Assassin’s Creed II 以意大利文艺复兴时期为背景，将历史虚构与Assassins和Templars之间的冲突结合在一起。故事讲述Desmond Miles通过Animus体验祖先Ezio Auditore da Firenze的记忆，以揭开秘密并阻止未来的灾难。在Ezio的时间线中，他最初是一个无忧无虑的贵族青年，但在父亲和兄弟因阴谋被处决后人生彻底改变。出于复仇，他成为Assassin并追捕敌人，同时发现了更大的Templars阴谋。在旅途中，他遇到Leonardo da Vinci，并探索佛罗伦萨和威尼斯等城市。随着时间推移，Ezio逐渐成熟并理解兄弟会的真正使命。故事以与Rodrigo Borgia的对决以及古代遗物的秘密揭示为高潮。整体上融合了个人复仇与关于自由和控制的哲学主题。